從最初的君臣相協，到現在王導的隱忍退讓，多次因爲刁協的彈劾而自請辭職;而爲王導辯解的中書郎孔愉，也被司馬睿降職爲司徒左長史。司馬睿與王氏兄弟，乃至士族之間的矛盾越來越深了。王敦爲自己的弟弟深報不平，他上疏司馬睿，望司馬睿能夠寬容王導犯下的過錯，令其將功補過。王敦這份上疏，動之以情，曉之以理。
然而司馬睿收到這份上疏後，對王敦卻更加忌諱了。他連夜將自己的叔父，譙王司馬承召進宮，與他商議對策。司馬承順承帝心，對此表現得十分憤慨，說：“陛下當初沒有早點遏制王敦的勢力，以至於到了今天這樣的地步。王敦一定會成爲朝廷的心腹大患”。劉隗更是在一邊煽風點火，讓司馬睿派遣心腹出鎮以提防王敦。恰好此時王敦表請宣城內史沈充代甘卓爲湘州刺史，司馬睿順勢命司馬承出鎮。司馬承萬死不敢推辭，然而行前的一番話已預示了他將來的結局。他對司馬睿說：“湘州經歷蜀寇，民物凋弊，如果我過去，一定要三年才能參加戰事，如果不到三年，即便我粉身碎骨，也沒有任何辦法。”果然，司馬承到了武昌以後，王敦設宴款待他，對他說：“大王知書達理，恐怕並非將才。”司馬承在司馬睿面前底氣不足，面對王敦時卻表現出十分傲氣，他對王敦說：“你怎麼知道我不是將才呢?即便是鉛刀，也有一割之用吧!”這樣的誇口，在久經戰事的王敦面前未免顯得有些可笑，因此王敦也並不在意，對心腹錢鳳說：“他沒有真正帶兵，並不知道戰場的可怕，不知恐懼而學人講壯語，可見他也沒什麼能耐，實在不足爲懼”。因此便聽之任之了。
司馬承的任命於江東大局其實並無十分影響，真正引起後來整個東晉局勢變化的，恐怕正是司馬睿在太興四年(公元321年)以尚書僕射戴若思爲徵西將軍、都督司、兗、豫、並、雍、冀六州諸軍事、司州刺史，鎮合肥，丹楊尹劉隗爲鎮北將軍、都督青、徐、幽、平四州諸軍事、青州刺史，鎮淮陰的軍事任命，“名爲討胡，實備王敦”。尤其是戴若思都督豫州軍事，令原豫州刺史祖逖十分不滿。他用盡一生心血經營邊疆，終於換來了十餘年和平，而這一切全都要交由戴若思接管，祖逖“意甚怏怏”，又知道司馬睿這次軍事任命，實際是爲了防備王敦，北伐就此不遂，因此悲憤發病而死。王敦雖然擅自任命官吏，但就目前能看到的史料而言，除卻史書評價說他有不臣之心以外，並無任何實際事蹟表明王敦有逼宮之嫌。而當戴若思、劉隗出鎮時，王敦開始也是從大局出發，寫信給劉隗說，“今大賊未滅，中原鼎沸，欲與足下及周生之徒戮力王室，共靜海內。若其泰也，則帝祚於是乎隆;若其否也，則天下永無望矣”，希望劉隗不要這樣步步相逼;然而劉隗不愧是政治上的矮子，斷然回信說：“‘魚相忘於江湖，人相忘於道術。’‘竭股肱之力，效力以忠貞’，吾之志也”，以王敦心氣之高傲，此時又手握重兵，先有司馬承出鎮湘州，後有戴若思、劉隗出鎮司、青，劉隗出言不遜，王導在朝中被司馬睿所猜忌疏遠——是可忍孰不可忍?
永昌元年(公元322年)，王敦於武昌起兵，上疏司馬睿，要求殺掉劉隗。這一次，他的上疏中帶了十足的威脅之意，“隗首朝懸，諸軍夕退...願陛下深垂三思，則四海乂安，社稷永固矣”，大有你不殺劉隗，我就不退兵之意。到了蕪湖，王敦再次上表，不過這次針對的目標是刁協。
司馬睿終於被王敦激怒，聲稱要親帥六軍誅討王敦，能夠取王敦項上人頭的，封五千戶侯。朝臣們很快做出了選擇。僕射周顗的態度可以說是代表了朝中大多數人的態度。太子中庶子溫嶠就王敦起兵這件事問他，周顗說，皇上不是堯舜，當然會有過失，做臣子的怎麼能夠舉兵相脅呢!一方面，他們認爲司馬睿的確有很多做得不對的地方，然而作爲臣子，王敦只能勸諫，而不能舉兵相抗。也因此，在王敦之亂中，我們可以看到，參與的人其實很少，大部分人都保持了中立的態度。響應王敦的，大多是琅琊王氏子弟，和王敦的心腹寵信。比如少時就酷愛兵書的沈充，以雄豪聞於鄉里，被王敦引爲參軍，與同郡錢鳳一起深得王敦信賴。因此當王敦舉兵內向時，沈充立刻在吳興起兵，王敦以其爲大都督、督護東吳諸軍事;王敦的兄長，光祿勳王含乘舟逃奔王敦。與此相對的，是譙王司馬承與梁州刺史甘卓的拒絕。司馬承的拒絕很好理解，他原本就是忠於晉室，此番出鎮乃是司馬睿的授意，因此當王敦讓參軍桓羆前去長沙將其請爲軍司，司馬承堅決不從，但卻也知道自己勢力單薄，不是王敦的對手，不免有“地荒民寡，勢孤援絕，將何以濟!然得死忠義，夫復何求”的感慨。而甘卓的考量就要複雜得多。他之前因爲多次參與平叛，因功被封爲湘州刺史，後遷爲安南將軍、梁州刺史、假節、督沔北諸軍，鎮襄陽。其在任期間，免除稅收，讓利於民，寬政簡惠，深得稱讚。王敦起兵後，曾希望甘卓能與自己一起發兵，但甘卓猶豫再三，終究還是拒絕，他與巴東監軍柳純、南平太守夏侯承、宜都太守譚該等十餘人發表檄文，說王敦謀逆，應加以討伐，又聯合陶侃，並命參軍鄧騫、虞衝至長沙，讓譙王司馬承堅守。甘卓之所以拒絕，並非爲朝廷考慮，而是權衡了司馬睿與王敦勢力孰優孰劣後作出的決定。因爲各方都積極響應甘卓，“徵西將軍戴若思在江西，先得卓書，表上之，臺內皆稱萬歲”，“陶侃得卓信，即遣參軍高寶率兵下”，因此即便是王敦，心裏也有些懼怕;剛好甘卓猶豫不定，屯兵豬口，王敦便派其侄兒甘仰求和，對甘卓說，“你這樣選擇，是盡臣節，我不會責怪你;然而我王家也沒有其他更好的辦法了，只能這樣做”，希望甘卓能班師回襄陽。
另一方面，王敦繼續行軍建鄴，司馬睿急召戴淵、劉隗入衛京師。劉隗回到建鄴後，與刁協一起力勸司馬睿盡誅琅琊王氏，然而也許司馬睿從一開始就沒有打算要真的對王家痛下殺手，只是惱恨臣強主弱的局面;而此時此刻的他終於明白，且不說他沒有能力誅殺王氏，即便他有，一旦他盡誅琅琊王氏，天下士人必定寒心，且江東豪族絕不是他與劉、刁諸人所能制衡的。因此在這個緊要關頭，司馬睿沒有同意。王導對此並不知情，見王敦起兵，他心憂如焚，率領族弟中領軍王邃、左衛將軍王廙、侍中王侃、王彬及諸宗族二十餘人，每天早上跪在宮門外待罪。司馬睿的立場原本就已經動搖了，再加上週顗的勸解，便命王導入宮覲見。王導十分惶恐，還不待司馬睿說話，就不停磕頭謝罪，說“沒有想到亂臣賊子竟然出在了臣的家族”!唯恐司馬睿怪罪更甚。司馬睿對王導的話，其實是半信半疑的。他雖然“跣而執其手”，光腳下階，拉住了王導的手，然而卻將王導任命爲前鋒大都督，要他大義滅親，前去討伐王敦;同時，以徵虜將軍周札爲右將軍、都督石頭諸軍事，甘卓爲鎮南大將軍、侍中、都督荊、樑二州諸軍事，陶侃領江州刺史，自己親着戎裝，率兵屯守郊外。王敦到了建鄴以後，原本想先攻劉隗，然而其部將杜弘卻勸他說，劉隗死士太多，恐怕不容易拿下，不如先從周札攻起，因其“少恩，兵不爲用，攻之必敗”。王敦同意了，於是轉攻周札。然而出乎意料的是，周札“開門納弘”，王敦不戰而勝，成功入據建鄴。究其原因，可以稍加推測。周札素有腳疾，“不堪拜，固讓經年”，而卻被有司彈劾，不得已只好前去視職。而史冊所載的有司，按當時朝中局勢而言，不是劉隗就是刁協諸人，因此周札之叛，也不難理解了。然而王敦進入建鄴後，並沒有感覺到絲毫勝利的喜悅，反而十分感慨地說：“吾不復得爲盛德事矣”!我如今起兵，雖然號稱是清君側，但不免會被當做逆臣，再也不會有什麼建功立業，盛名遠揚的機會了。雖然這樣感慨，但王敦擁兵不前，放任士兵到處劫掠財物，宮中諸人紛紛逃散，彷彿是無聲的示威。司馬睿原本命刁協、劉隗、戴淵、王導等人連續出戰以攻建鄴，在幾番戰敗後，他也喪氣了，脫下戎裝對左右說：“如果王敦想要我這個位置，早點說不就好了?何必要將百姓拖累到這樣的地步呢?”一句話輕輕巧巧地便將前因後果全部撇得乾淨，彷彿王敦是因爲早就覬覦帝位才起兵的。他又遣使對王敦說，如果你不忘晉室，那就息兵吧，這樣天下或可安定，否則的話，“朕當歸琅邪以避賢路”。後人多以爲王敦狼子野心，纔將司馬睿逼到這樣的地步，然而聯繫前後因果，可知王敦這次起兵，的確是不滿劉隗、刁協干預朝政，小則損害琅琊王氏的利益，大則動搖江東豪族擁立之心，絕無不臣之意。而司馬睿對王敦這樣說，其實也是威脅十足，如果不就此退兵，那麼圖謀篡位這頂帽子，王敦就戴定了。也因此王敦退兵，司馬睿以其爲丞相、都督中外諸軍、錄尚書事、江州牧，封武昌郡公，王敦都沒有接受，但殺掉了協助司馬睿的戴若思、周顗，刁協在逃跑路上爲人所殺，送首於王敦;而劉隗則攜妻子親信投奔了石勒，石勒以其爲從事中郎、太子太傅——再次體現了劉、刁二人之無有骨節。而得知了戴若思、周顗死訊的甘卓，方寸大亂，不久就爲襄陽太守周慮所殺掉了。
雖然《資治通鑑》記載說，當初四方勸司馬睿稱帝的時候，王敦就已經有不臣之心，想改立其他王儲，因爲王導不同意而作罷，然而還是那句話，評論不足爲據，沒有任何切實的事例能夠表明那時候的王敦想要取晉室而代之。但這次變亂卻也讓王敦反過來思考晉元帝一脈是否值得擁護。他責備王導沒有聽從自己的話，改立他人爲帝，以至於現在差點被滅族，這句話雖然真假也有待商榷，但“幾至覆族”的後怕，一定縈繞在王敦心頭，成爲揮之不去的一個陰影。更何況，王敦清楚地知道，即便很多人與自己的立場相同，但出於各種考量，多數人現在對自己的定義，無怪乎“亂臣賊子”四個字。譬如周顗死前經過太廟，大呼“賊臣王敦，頃覆社稷，枉殺忠臣;神祗有靈，當速殺之”!其族弟王彬在憑弔周顗後，勃然怒斥王敦屠戮忠良，欲謀不軌，禍及門戶等等。大概也有些破罐破摔的意味，王敦漸漸起了謀廢立的心思。他原本想廢黜太子司馬紹，重新迎立東海王司馬越的後裔與裴妃，然而因爲溫嶠直言相抗，羣臣以沉默表示反對而作罷。
然而此時的王敦，兵權在握，其實也不太在乎朝臣的意見了。他以西陽王司馬羕爲太宰，加王導尚書令，王廙爲荊州刺史，進行了一次軍事、行政大調動，“轉徙黜免者以百數”，十分恣意。謝鯤勸他說，您雖然誅滅佞臣，建有功勳，但入朝以來，一直都稱病不去面聖，若是能去覲見天子，君臣釋然，一定人情所歸，天下盡樂。王敦反問謝鯤，你能保證不發生什麼變故嗎?縱然有謝鯤的保證，但王敦根本不信任司馬睿，終究還是沒有覲見司馬睿，帶兵返還了武昌。但司馬睿經過此事後，憂懼成疾，不久後就去世了。太子司馬紹即位，是爲晉明帝。
從這個時候開始，王敦變得漸漸和從前不一樣了。他“暴慢滋甚，四方貢獻多入其府，將相嶽牧皆出其門”。雖然史載其所任用的沈充、錢鳳兇險驕恣，大起營府，侵人田宅，剽掠市道，但就史冊而言，跟隨王敦的時候，並沒有太多沈、錢二人“兇險驕恣”的實證。相反，這兩人對王敦相當忠誠。尤其是沈充，當晉明帝準備討伐王敦時，曾讓其鄉人沈禎前去勸他，許諾事成後將他提拔爲司空，也許是對晉明帝的不信任，然而畢竟沈充寧死，也不肯折節背叛王敦。反倒是王敦自己，脾氣越發暴虐易怒了。當時高官督護繆坦想將武昌城西地作爲軍營，太守樂凱勸諫說，這塊地是百姓用來種菜的，不應該將其奪走。王敦聽了大怒，說：“若不是我來這裏，會有武昌這個地方嗎?人們說這裏的土地都是我的!”樂凱不敢再說，最後還是郭舒不畏王敦，委婉進諫，王敦纔將地還給了百姓。這樣的事情還有很多，因此這時《晉書》中對他的評價，“多害忠良，寵樹親戚”，也不可謂不客觀了。
除此以外，王敦還讓朝廷徵召自己，以謀更大。晉明帝心思慎密，是爲深諳權術的皇帝，不欲與此時兵力強盛的王敦相抗，因此從善如流，手詔徵之，加黃鉞、班劍，奏事不名，入朝不趨，劍履上殿，暗地裏卻在謀劃如何削弱王敦的勢力。雖然他曾想以流民帥郗鑑的勢力爲外援，自己又親自前往王敦兵營查看地形，但這一切都比不上中書令溫嶠的無間道效果好。王敦曾以溫嶠爲左司馬，溫嶠事事配合，深爲王敦所重，並假意結交錢鳳，稱讚他說“錢世儀精神滿腹”。溫嶠向來品藻人才聞名，得他一讚，錢鳳也對他十分傾心。太寧二年(公元324年)六月，王敦表情溫嶠爲丹楊尹，希望他藉機監視朝廷動向。溫嶠臨走前，假裝酒醉冒犯錢鳳，以至於他走後，錢鳳對王敦說，“此人與朝廷往來過密，不能信任”的時候，王敦反而指責錢鳳不應該爲了溫嶠酒醉冒犯的事而耿耿於懷。當知道溫嶠背叛了自己以後，王敦大怒，寫信給王導說要將溫嶠抓來拔掉他的舌頭。然而此時的王敦，無疑心有餘而力不從心了——他已經病到了錢鳳直接問他後事如何的地步了。王敦知道自己若是病死，手下人必定成不了大事，便以養子王應爲武衛將軍，王含爲驃騎大將軍、開府儀同三司，又給了錢鳳三條建議，“釋兵散衆，歸身朝廷，保全門戶，上計也;退還武昌，收兵自守，貢獻不廢，中計也;及吾尚存，悉衆而下，萬一僥倖，下計也”。然而錢鳳政治才幹也十分堪憂，認爲王敦所謂的下計，乃是上上之策。與此同時，晉明帝以司徒王導爲大都督、領揚州刺史，溫嶠都督東安北部諸軍事，與右將軍卞敦守石頭，應詹爲護軍將軍、都督前鋒及硃雀橋南諸軍事，郗鑑行衛將軍、都督從駕諸軍事，庾亮領左衛將軍，吏部尚書卞壼行中軍將軍。又詔徵臨淮太守蘇峻、兗州刺史劉遐及徐州刺史王邃、豫州刺史祖約、廣陵太守陶瞻等入衛京師。王導聽說王敦病入膏肓，帥琅琊王氏諸子弟爲王敦發喪，以至於衆人都以爲王敦已經去世，頓時鬥志昂揚。
不得不說，沒有王敦帶領的軍隊，其實與烏合之衆沒有什麼區別，更何況晉明帝手下諸位將領，皆是一時才俊，因此王敦部衆節節敗退。當聽到自己的哥哥王含戰敗的消息時，王敦大怒，但同時也明白大勢已去，不可挽回了。他本欲自己出徵，畢竟身體已經不允許了，只好告訴少府羊鑑與王應說，等他死後，“先立朝廷百官，然後營葬事”。說完後不久，王敦就去世了，時年五十八。
王應的確沒有發喪，他所做的，是用席子將自己養父的屍體草草裹了，在外邊塗上蠟，埋在廳堂下面，與諸葛瑤等日夜縱酒淫樂。不久，王敦部將俱被擊潰，而王敦的屍體也被挖出來，“焚其衣冠，跽而斬之”，與沈充的頭顱一起掛在城南朱雀桁上示衆，若不是後來朝廷許可，甚至都沒有人敢爲他收屍。
