發明成就
兩項發現
1921年，患重感冒的弗萊明堅持工作，在一培養基中發現溶菌現象，細究之下原來是鼻涕所致，由此發現了溶菌酶。
1928年7月下旬，弗萊明將衆多培養基未經清洗就摞在一起，放在試驗檯陽光照不到的位置，就去休假了。9月1號，在工作22年後，他因溶菌酶的發現等多項成就，獲得教授職位。9月3號，度假歸來的弗萊明，剛進實驗室，其前任助手普利斯來串門，寒暄中問弗萊明這段時間在做什麼，於是弗萊明順手拿起頂層第一個培養基，準備給他解釋時，發現培養基邊緣有一塊因溶菌而顯示的慘白色，因此發現青黴素，並於次年6月發表，最終使其獲諾貝爾獎的論文。
成就背景
弗萊明要遇到青黴菌所致的溶菌現象，究竟需要多少偶然因素之間的相互配合才能出現。有人曾爲此專門著文闡述。首先，青黴菌適合在較低溫度下生長，葡萄球菌則在37度下生長最好。其次，在長滿了細菌的培養基上，青黴菌無法生長。最後，青黴菌大約在5天后成熟併產生孢子，這時青黴素纔會出現，而青黴素也只對快速生長中的葡萄球菌有溶菌作用。
成就保障
因此，弗萊明的發現，至少需有下述四方面的條件作保障。
1、來源不明的青黴菌孢子落入葡萄球菌培養基中。
2、弗萊明未將培養基放在37攝氏度的溫箱中，也未清洗，而是放置在室溫下。
3、天氣的配合。當年的氣溫記錄顯示，恰好在7月28至8月10，倫敦有一段十分難得的涼爽天氣，極其適合青黴菌先行生長成熟，併產生了青黴素。而8月10號以後，氣溫則明顯升高有利於葡萄球菌快速生長，以至於發生了溶菌現象。
4、或許還要加上，在弗萊明剛進實驗室，尚未着手清洗培養皿時，其前任助手恰好到來敘舊。
性格
弗萊明是一個腳踏實地的人。他不尚空談，只知默默無言地工作。起初人們並不重視他。他在倫敦聖瑪麗醫院實驗室工作時，那裏許多人當面叫他小弗萊，背後則嘲笑他，給他起了一個外號叫“蘇格蘭老古董”。有一天，實驗室主任賴特爵士主持例行的業務討論會。一些實驗工作人員口若懸河，譁衆取寵，惟獨小弗萊一直沉默不語。賴特爵士轉過頭來問道：“小弗萊，你有甚麼看法?”“做。”小弗萊只說了一個字。他的意思是說，與其這樣不着邊際地誇誇其談，不如立即恢復實驗。到了下午五點鐘，賴特爵士又問他：“小弗萊，你現在有甚麼意見要發表嗎?”“茶。”原來，喝茶的時間到了。這一天，小弗萊在實驗室裏就只說了這兩個字。
爭議
有人指出，弗萊明雖然發現了青黴素，卻只發表了兩篇論文，而有關青黴素在醫學上可能存在的價值，只在其第二篇論文中明確提到過一次，“青黴素或者性質與之類似的化學物質有可能用於膿毒性創傷的治療”，這就是他對青黴素功用所作出的唯一預言。
有人甚至在紀念弗萊明貢獻的一次演講中指出，弗萊明1929年那篇劃時代論文中，沒有引用，在1928年法國出版，一本專門闡述黴菌和其它細菌，在抑菌觀察方面的有關文獻的專著，以此說明弗萊明並不真的明白青黴素的價值。而其後，弗萊明即未積極分離純化青黴素，也未積極推動青黴素的研究，以使它成爲一種治療用的藥物(這些事務均是牛津小組——弗洛裏和錢恩爲主要人員——所作)。甚至沒有妥善保存他所發現的青黴菌菌種，而是一位有遠見的倫敦衛生和熱帶醫學學院的教授Raistrcik將之保存，後來交給牛津研究小組。
還有人認爲，青黴素之所以能迅速在臨牀大面積推廣使用，得益於殘酷的二戰以及日本偷襲珍珠港，促使美國加入戰局，否則錢恩恐怕很難成功遊說美國投入到青黴素的研發中。因爲，青黴素的分離純化極其困難，其水溶液極不穩定，很容易分解失效。而且其粗提物口服情況下對天竺鼠的致死性很高，若按現 在的情況看，沒有人會認爲這個藥物值得開發。而弗萊明當初發現的菌株，產量極低。高產量菌株是在美國發現的，而一系列關鍵性技術和臨牀研究都是在美國實現的。
也有人指責，初期的媒體宣傳，完全是弗萊明的個人舞臺。而牛津小組所作的諸多實際而艱辛的工作，要麼被忽略要麼被一筆帶過，總之牛津小組被人遺忘了。而沒有牛津小組，就算弗萊明要做，也造不出藥物來。對此，1999年的《美國新聞與世界報道》週刊中，對1945年同獲諾貝爾獎的三個人配發了耐人尋味的說明文字。弗萊明——他對攝影師來者不拒;弗洛裏——對新聞界冷如冰霜;錢恩——年輕的生化學家，分析並提純了青黴素。
評價
儘管弗萊明曾遭受非議，但毋庸置疑的是，青黴素已挽救了數以百萬計人的生命，並且將來肯定還將繼續挽救更多的人，這其中大部分榮譽還是應當歸功於弗萊明，是他完成了最重要的發現。正如牛津病理學系主任哈里斯所說：“沒有弗萊明，不會有錢恩及弗洛裏;沒有錢恩，不會有弗洛裏;沒有弗洛裏，不會有希特利;沒有希特利，則不會有盤尼西林。
軼事
有一個廣爲流傳的故事，說弗萊明的農夫父親曾救過小時候的丘吉爾，丘吉爾之父出資讓弗萊明上學成才，而後丘吉爾本人又在二戰中因青黴素而從瀕死的疾病中獲救。弗萊明給朋友的信中證實，這是誤傳，而且後來挽救丘吉爾的藥物也不是青黴素。
