查士丁尼於483年出生於色雷斯斯科普里的一個農民的家庭裏。
他的叔父查士丁(450—527)出身行伍，以作戰有功升任禁衛軍統領。查士丁一世只是一個目不識丁的色雷斯農民，靠軍隊發跡，爬上東羅馬君主寶座。查士丁一世對自幼跟隨着自己的侄兒查士丁尼寄予了厚望，讓他受到了良好的教育。
從518年後，查士丁尼就協助叔父掌理政務，擔任帝國行政指導。
於518年，查士丁被擁立爲拜佔廷皇帝，是爲查士丁一世。查士丁尼以養子身份協助查士丁一世制訂國內外的重要政策，並獲得“愷撒”和“奧古斯都”的封號。
527年8月，查士丁一世去世，查士丁尼成爲拜佔廷帝國皇帝。
查士丁尼即位後，爲自己確定了主要的政治目標：“收復”西部領土，恢復基督教的羅馬帝國。他爲此常常徹夜不眠，費盡心機，幾乎到了發狂的地步，以致當時有人驚呼：查士丁尼不是人，而是個絲毫不需要休息的惡鬼!
在他身邊爲他出謀劃策的人物中間，最重要的一個就是皇后提娥多拉(約500—548)。提娥多拉以前是君士坦丁堡劇院的一個伶人和名妓，被查士丁尼看中，於523年結爲夫婦。查士丁尼執政後，提娥多拉成爲很有權勢的人物，對查士丁尼政事產生重大影響。
查士丁尼首先採取措施鞏固帝國的內部，統治任命10人組成的委員會(以後又組成16人委員會)，系統編纂羅馬帝國的法律。全部編纂工作從528年開始，到534年告竣，歷時6年。
法典包括兩個綜合部類，一類是由政府頒佈的各種法令，稱爲成文法;另一類是著名法學家對法令的論述和闡釋。委員會收集了自哈德良以來歷代皇帝所頒佈的法令，刪除過時和相互矛盾部分，於529年編成《查士丁尼法典》共10卷。
533年編成《法學彙纂》，共50卷，收集了歷代法學家的論文。同年又頒佈《法理概要》，或稱《法學家指南》，簡要闡明法學原理，作爲學習羅馬法的教材。
在法典編纂工作完成以後，查士丁尼又陸續頒佈了168條敕令。這些敕令，當時未被列入法典，到了565年也被編輯成集，稱爲《新法典》作爲查士丁尼法典的補充。查士丁尼時代彙集整理的全部羅馬法律文獻，統稱《羅馬民法彙編》。
這是歐洲歷史上第一部系統完全的法典。它確定了統一的無限私有制概念，提出了公法和私法的劃分：“公法是有關羅馬帝國政府的法律，私法是有關個人利益的法律。”私法基本上分人、物、對物權、對人權(即債、契約等)以及民事訴訟等五個部分，體現了私有制和商品交換本質的法律關係問題。
恩格斯稱羅馬法爲“以私有制爲基礎的法律的最完備形式”，是“商品生產者社會的第一個世界性法律”。其所具有的意義大大超出了上古和中世紀社會的範圍。從十二世紀起，西歐重新恢復對羅馬法的研究，《羅馬民法彙編》成爲各國研究和制定法律的基礎。其中的公法對後世無多大影響，而私法則對近代歐洲各資產階級國家的立法起了重大的作用。
查士丁尼編纂法典的目的，是爲了鞏固帝國的統治。法典中滲透君主專制的思想，極力歌頌君權，認爲“沒有任何東西再比皇帝陛下更高貴和更神聖”，“只有他(皇帝)一個人能夙興夜寐，爲人民的幸福着想”，皇帝的旨意具有法律的效力,，誰反對皇帝就要遭到法律的懲治。查士丁尼在法典中把君權同神權結合起來，第一個提出君權神授的思想，宣傳皇帝直接得到“天惠”來統治人民，使君權神聖化。
爲了鞏固奴隸主對奴隸和隸農的統治，阻止在帝國內部已經孕育的封建因素的發展，法典一再強調奴隸和隸農的依附地位，他們必須服從主人，“都應該服從自己的命運”，不得有任何反抗。由於拜佔廷的奴隸制度正在發生變化，使用奴隸勞動已不再能獲得厚利，《新法典》不得不規定允許釋放奴隸，隸農則仍須固着在土地上，以保證大地主有充足勞動力。
查士丁尼還利用基督教來作爲其專制政體的支柱。他登臺不久，即宣佈自己是國教東正教的保護者，首要責任就是要根絕一切異端。他限令所有異教徒在三個月之內都得改奉正教，不許他們擔任國家官職，沒收他們的寺院並移交給正教徒，甚至把沉重的勞役和兵役加在他們頭上。
529年，查士丁尼將雅典的一所著名的哲學院作爲異教團體加以封閉，將其中七位有名學者放逐到波斯。529—530年，他又鎮壓了巴勒斯坦的撒馬利亞教派的反抗。但使他最感棘手的則是一性論教派，這個教派只承認基督具有有神性，反對官方教會的富有和腐化，要求神職人員放棄世俗的財富和享受。這種教義早在埃及、敘利亞等地傳播，當地被壓迫人民參加這個教派，利用這一宗教異端來反對帝國的統治。
530年，帝國政府在敘利亞安提阿頒佈命令，凡不承認查爾西頓宗教會議的予以放逐。大規模的反抗運動迅速興起。536年，皇后提娥多拉的親信狄奧多西被派往亞歷山大任大主教，這又激起了埃及人民的反抗。反抗雖然被鎮壓下去，但查士丁尼卻深深感到繼續對一性論教派採用高壓手段會危及他的統治。
他採納了皇后提娥多拉的意見，力圖與這一教派妥協，把被放逐的那些一性論教派的主教釋放回來，並設法調和一性派教徒與帝國政府、官方教會的矛盾。這些努力並未能消除一性論教派的反抗情緒。
在查士丁尼統治時期，拜佔廷在經濟上還保持相對穩定，城市繁榮，工商業興盛，但是城鄉勞動人民所創造的大量財富，都被帝國政府耗費在維持龐大的官僚機構和人數衆多的軍隊、對內鎮壓人民、對外發動戰爭等方面。
帝國政治十分腐敗，貪污、賄賂、賣官鬻爵成風。從朝廷到行省大小官員，無不濫用職權，對人民敲榨勒索。爲了加強中央集權，查士丁尼曾經在行政上作過一些改革。譬如，簡化行政機構，裁減官員，加強中央與地方聯繫等。
另外還對一些擁有大地產併力圖與中央政府分庭抗禮的元老院貴族進行了鬥爭，但未取得明顯效果。查士丁尼本人在這一時期又大興土木，在首都君士坦丁堡興建了宏偉宮殿和堂皇的聖索非亞教堂。
爲了抵禦外族入侵，查士丁尼還到處修築橋樑，敷設道路，從多瑙河到阿爾明尼亞高山及幼發拉底斯河兩岸，沿途建立了幾百座要塞，構成防衛網。爲完成這些規模巨大的工程所需大量資金和繁重勞動無疑落在勞動人民的頭上。
查士丁尼一世是一位“不眠的皇帝”，他親自管理許多事情。他的法典是全新的，其作用一直延續到近代。他本人對城市和省份的管理也非常關心。但他也不得不經受一些打擊，其中最主要的是尼卡暴動。
登位後，爲了爭奪高加索通往黑海的出口，以及參加對東方貿易競爭,即與薩珊波斯展開爭奪戰，但是長此下去，不利於爲在意大利和北非恢復古羅馬帝國而進行的戰爭。因此查士丁尼於532年不惜以賠款11,000磅黃金爲代價，與波斯締結了和約。
對於巴爾幹北部諸蠻族部落的進攻，也是以重金收買酋長的方式求得和平。這樣，暫時穩定了東方和北方的邊境。查士丁尼隨即集中兵力向西，企圖消滅建立在西羅馬帝國舊址上的蠻族國家。533年，查士丁尼藉口其同盟者希爾得西斯被廢，派大將貝利撒留率軍入侵北非汪達爾王國。
他利用汪達爾貴族內訌以及當地部落與汪達爾上層統治者之間的矛盾，勾結舊奴隸主和教會勢力,攻佔王國首都迦太基，消滅汪達爾王國，在北非恢復帝國的行政機構。
535年，查士丁尼製造了另一藉口，即東哥特攝政王后愛瑪拉森莎被殺害事件，命貝利撒留渡海進兵意大利，攻打東哥特王國。貝利撒留軍隊在西西里登陸，536年攻打羅馬。
查士丁尼下令在意大利恢復奴隸制制度和舊日羅馬的地方行政機關，讓過去的奴隸主重新上臺。他們對奴隸和隸農反攻倒算，奪回土地,搜查隸農和奴隸。使那些已經獲得自由的人全都陷入淪爲奴隸的困境。帝國政府還在意大利竭力搜刮民財，濫徵苛捐雜稅，使得居民不禁懷念起蠻族統治時期的處境。
查士丁尼在北非、意大利的倒行逆施,激起了當地人民的強烈反抗。他們紛紛支持汪達爾人和哥特人起來繼續與拜佔廷軍隊鬥爭。北非人民在斯多查的領導下舉行起義，堅持十年(536—546)。
意大利的奴隸和隸農支持東哥特國王託提拉對抗侵略軍。在一個時期內，託提拉軍勢極盛,收復了大部分土地。把貝利撒留逼到半島的西南部。後來，查士丁尼派軍隊從意大利北部增援，才於555年消滅了東哥特王國。
查士丁尼在征服意大利的同時，利用西哥特王國內亂之機，領了西班牙的東南部。科西嘉、撒丁尼亞、巴利阿利羣島以及達爾馬提亞等地，都先後併入拜佔廷版圖。至此，拜佔廷帝國已囊括西羅馬帝國的絕大部分舊有領土，比它原有的領土面積幾乎擴大了一倍。
但是，查士丁尼的功業未能持久。長期的對外戰爭削弱了帝國的軍事和財政力量。自555年後，查士丁尼已無力發動新的戰爭，貌似強大的拜佔廷帝國在同斯拉夫人、匈奴人以及在同波斯的戰鬥中，總是吃敗仗。
被征服地區的人民的反抗鬥爭日益激化，一性論教派在敘利亞，美索不達米亞、埃及等地仍然堅持鬥爭。面臨這種形勢，查士丁尼一籌莫展，只好以研究神學問題來“排遣”，最後在565年1月死去。他的繼承人查士丁二世即位後曾經驚呼道:“我們的國庫空虛，負債累累，達到極端貧困的境地，軍隊也趨於瓦解，以致國家遭到蠻族不斷的侵襲與騷擾”，這就是查士丁尼留下的殘破局面。
查士丁尼死後。帝國在西方的領地相繼喪失。568年,意大利北部和中部被倫巴德人侵佔。隔了10多年，拜佔廷在西班牙的領地被西哥特人收復。查士丁尼恢復奴隸制羅馬帝國的反動政策終於徹底破產。
