醫院騎士團是西歐中世紀曆史上出現的著名的三大騎士團之一。醫院騎士團的建立直接與朝聖活動的主體———朝聖者之間有着深刻而緊密的關聯。絡繹不絕的朝聖者來往於聖地與西歐之間，而這其中有一批把宗教和貿易緊密聯合起來的朝聖者，他們就是意大利阿馬斐商人。據說，也是他們組建了最早的醫院騎士團，他們所管轄的醫護院不加歧視的接待所有來自西歐的朝聖者。醫院騎士團產生於十字軍東征期間，此時也正是伊斯蘭教穆斯林與西方天主教徒，尤其西方的封建貴族騎士階級之間最深刻的衝突時期，醫院騎士團在此期間擔負着保衛拉丁國家和照顧朝聖者、窮人和傷患的責任。醫院騎士團的興起與發展與十字軍運動相伴而生，騎士團的主要活動區域是十字軍東征的中心區，即中東地區，而12-13 世紀時，十字軍運動方興未艾之時，也是醫院騎士團發展的頂峯時期。
1126 年，醫院騎士團擁有了軍事審判權，此後醫院騎士團轉變爲軍事宗教騎士團。1135 年，醫院騎士團從教皇英諾森二世那裏獲得了對禁令和開除教籍的豁免權。醫院騎士團從此完全擺脫教會的司法管轄，這標誌着醫院騎士團成爲了獨立的組織。1139 年，醫院騎士團還接受了阿方索一世給予的位於伊比利亞半島上的一大片領土。1142 年-1144 年，醫院騎士團還接受了的黎波里伯爵給予的位於其王國邊境地區的城堡。騎士團在的黎波里恢復了許多要塞的秩序並加速軍事化，此後的醫院騎士團在的黎波里公國簡直就成了擁有大片領地的獨立王國。在1126 年醫院騎士團變成軍事宗教騎士團以後的二三十年間，其在聖地已經家喻戶曉。
1187 年，耶路撒冷被撒拉丁攻佔，醫院騎士團的中心轉到海濱城市阿克，1191 年7 月在阿克重新建立了基地。在1190—1193 年間醫院騎士團在面對統一的穆斯林國家時候，通過參與軍事活動對保衛十字軍國家起到了協助作用。1268 年由醫院騎士團鼓動的對埃及的遠征遭到失敗後，醫院騎士團不再主動參與十字軍對穆斯林的戰鬥。但此時的醫院騎士團的軍事體系和組織已經基本完備。在第五次十字軍東征中，醫院騎士團發揮自主權極力避免介入軍事活動，這種行爲受到了教皇和世俗君主的指責。在整個13 世紀，醫院騎士團卻捲入了拉丁國家紛繁複雜的政治鬥爭中。
從1265 年起埃及馬穆路克蘇丹發起了對十字軍國家的全面進攻。短短的二十多年時間，十字軍在中東、敘利亞地區的領土逐漸落入穆斯林之手。1291 年5 月18 日穆斯林開始攻打阿克，阿克隨即陷落。醫院騎士團總部轉移到塞浦路斯，以此作爲攻擊敘利亞和巴勒斯坦穆斯林的橋頭堡，醫院騎士團將其所擁有的珍貴的聖蹟和聖物也轉移至塞浦路斯，但由於醫院騎士團在塞浦路斯島上的活動受到限制，塞浦路斯內部王國之間的政治動亂導致該島並不適合做醫院騎士團長久的軍事基地和總部所在地。同時教皇也計劃和考慮將幾大騎士團合而爲一，雖然最後由於各騎士團的強烈反對而最終未能實施，但也對醫院騎士團也是一個打擊。由於醫院騎士團介入塞浦路斯內部的政治鬥爭，加上醫院騎士團在該島上財政狀況不斷惡化，導致醫院騎士團在此無法立足。
1306 的醫院騎士團從拜占庭手中得到位於希臘沿岸的羅德島，島上很富庶且有很高的戰略價值，可以控制愛琴海地區。從此醫院騎士團也可以稱爲羅德島騎士團。在此，醫院騎士團一直堅持到奧特曼帝國攻佔羅德島。1312 年教皇將解散後的聖殿騎士團的財產大部分都贈予了醫院騎士團。雖然醫院騎士團在羅德島有了一個穩固的基地，但此時的醫院騎士團即陷入了內部的紛爭，團長曾幾度易手，同時由於受到了教會大分裂的影響，教皇也插手醫院騎士團的內部事務。雖然內部的紛爭削弱了醫院騎士團的力量，但騎士團還是在以前大力發展的海軍力量基礎上增強了軍事力量，海上成爲了他們主要活動地域。他們參加了當時出現的許多海軍同盟，在巴爾幹和愛琴海地區充當了主要的軍事力量。
14 世紀中期醫院騎士團開始大量的負債。儘管如此，醫院騎士團在地中海區域還是成功阻擋了馬穆路克人和奧斯曼土耳其人的攻勢，羅德島自此也成爲東西方交流與貿易的主要中心。醫院騎士團也同土耳其人和馬穆路克維持了暫時的平衡。但1421 年醫院騎士團面臨更大的困境，西歐此時正經歷英法百年戰爭，而遍及歐洲的宗教改革鬥爭也使醫院騎士團陷入了財政危機。新的馬穆路克統治者和奧斯曼土耳其蘇丹都開始採取攻勢，先後攻佔了巴爾幹、愛琴海沿岸和塞浦路斯。對醫院騎士團構成最大威脅的是埃及馬穆路克蘇丹， 1440 年和1444 年馬穆路克對羅德島進行了兩次大規模的進攻。雖然馬穆路克人最後撤退，但醫院騎士團在羅德島的基礎設施和戰鬥人員遭到了嚴重破壞。1453 年奧斯曼人又攻佔了君士坦丁堡，東方的形勢更加嚴峻。土耳其人不久後攻佔了羅德島附近的大小島嶼，直接威脅到了醫院騎士團的安全。1479 到1480年，醫院騎士團儘管抵擋住了奧斯曼人的進攻，但羅德島最終於1522 年在新一任奧斯曼土耳其人蘇丹蘇萊曼的進攻下陷落。
1530 年，醫院騎士團撤退到馬耳他島並在此重新建立總部。到此時，醫院騎士團又可以稱爲馬耳他騎士團。醫院騎士團在該島上的中心主要是在主島上。它已經不再處於西方朝聖者所必經的路線上，因此醫院騎士團損失了大部分的捐贈收入而陷入了新的財政危機。馬耳他島在醫院騎士團進駐之前曾幾度易手，有西西里王國，還有阿拉貢王國，還有神聖羅馬帝國，由此醫院騎士團不可避免的捲入西歐的政治鬥爭旋渦。1565 年醫院騎士團抵擋住了土耳其人對馬耳他的圍攻。這一次成功的防禦使醫院騎士團重新贏得了聲譽。由於西歐紛紛伸出了援手，醫院騎士團加強了主島的防禦，並暫時解決了財政危機，此後醫院騎士團加入了新組建的海軍同盟。
18 世紀末期，劇烈變化的國際形勢使醫院騎士團失去了存在的價值。俄國崛起使人們相信土耳其人不再是威脅，而啓蒙思想與宗教思想的革新也使聖戰和十字軍的觀念不再與時代和諧，醫院騎士團走入了信念危機。1798 年馬耳他騎士團在拿破崙率領的法國軍隊的進攻下投降。至此，醫院騎士團的主要歷史結束。
